Việc xác định bản chất hóa học của một chất dẫn truyền thần kinh thường khó thực hiện bằng các thí nghiệm. Ví dụ, ta có thể dùng một kính hiển vi điện tử để nhận dạng cúc xi-náp nằm ở vùng trước xi-náp, nhưng không dễ để nhận ra chất hóa học được đóng gói trong đó. Khó khăn này đã dẫn đến nhiều cuộc tranh cãi xem một chất có phải là chất dẫn truyền thần kinh hay không. Với nỗ lực dàn xếp các cuộc tranh cãi này, các nhà hóa học thần kinh đã thiết lập các quy tắc dễ áp dụng trên thực nghiệm. Theo những gì mà người ta tin trong những năm 1960, một chất hóa học được xem là một chất dẫn truyền thần kinh nếu chúng thỏa mãn các điều kiện sau:

• Có các tiền chất hoặc/và các enzym tổng hợp của chất đó trên vùng trước xi-náp của xi-náp.
• Chất đó có mặt trong thành phần của vùng trước xi-náp.
• Chất đó có mặt trong nơ-ron trước xi-náp với một lượng đủ để tác động lên nơ-ron sau xi-náp.
• Có các thụ thể của chất đó nằm ở vùng sau xi-náp.
• Có một cơ chế hóa sinh để làm bất hoạt chất đó.

Các tiến bộ trong dược lý học, di truyền học, và giải phẫu học thần kinh hóa học đã làm giảm đi rất nhiều sự quan trọng của các quy tắc trên. Các thí nghiệm mà trong những năm 1960 phải mất nhiều năm mới hoàn thành thì ngày nay có thể được làm xong trong vài tháng, với độ chính xác cao hơn rất nhiều. Do đó, vào ngày nay, việc xác định một chất hóa học có phải là chất dẫn truyền thần kinh hay không rất hiếm khi là một đề tài tranh cãi trong một quãng thời gian dài.